Gramas krāsošana ir ātra metode, un to izmanto, lai redzētu baktēriju klātbūtni audu paraugā un klasificētu baktērijas kā grampozitīvas vai gramnegatīvas, pamatojoties uz to šūnu sieniņu ķīmiskajām un fizikālajām īpašībām. Gramas traipu gandrīz vienmēr izmanto kā pirmo soli bakteriālas infekcijas diagnosticēšanā.
Šī krāsošanas metode ir nosaukta dāņu zinātnieka Hansa Kristiana Grama (1853 - 1938) vārdā, kurš šo metodi izstrādāja 1882. gadā un publicēja 1884. gadā kā paņēmienu, lai atšķirtu divu veidu baktērijas ar līdzīgiem klīniskiem simptomiem: Streptococcus pneumoniae (pazīstams arī kā Streptococcus pneumoniae). Pneimokoki) un baktērijas Klebsiella pneumoniae.
Solis
1. metode no 3: Mikroskopa slaida sagatavošana
Solis 1. Sagatavojieties darbam laboratorijā
Valkājiet cimdus un garu matu kaklasaiti, lai novērstu pārbaudāmā parauga baktēriju piesārņojumu. Notīriet darba vietu zem tvaika nosūcēja vai citā labi vēdināmā vietā. Pirms darba sākšanas pārbaudiet Bunsen degli un pārliecinieties, vai mikroskops darbojas pareizi.
2. solis. Sterilizējiet mikroskopa stikla priekšmetstikliņu
Ja stikla slaids ir netīrs, nomazgājiet to ar ziepjūdeni, lai notīrītu eļļu un netīrumus. Notīriet priekšmetstikliņus ar etanolu, stikla tīrīšanas līdzekli vai citu metodi, ko izmanto jūsu laboratorija.
3. solis. Novietojiet paraugu uz stikla priekšmetstikliņa
Jūs varat izmantot Gram traipu tehniku, lai palīdzētu noteikt baktērijas medicīniskajā paraugā vai baktēriju kultūru, kas aug Petri trauciņā. Lai iegūtu vislabākos rezultātus, izmantojiet Gram traipu uz plāniem parauga sitieniem. Ieteicams izmantot paraugus, kas ir jaunāki par 24 stundām, jo vecākas baktērijas, iespējams, ir sabojājušas šūnu sienas un var nereaģēt uz Gram krāsošanu.
- Ja izmantojat audu paraugu, pievienojiet 1-2 pilienus stikla priekšmetstikliņam. Vienmērīgi izklājiet uz priekšmetstikliņa, veidojot plānu parauga smidzināšanas kārtu, bīdot to, izmantojot otra sterila stikla priekšmetstikliņa malu. Pirms nākamās darbības veikšanas ļaujiet tai nožūt.
- Ja jūs ņemat baktērijas no Petri trauciņa, sterilizējiet inokulācijas cilpu Bunsena degli, līdz tā iedegas, un ļaujiet tai atdzist. Izmantojiet cilpu, lai pilinātu sterilu ūdeni uz priekšmetstikliņa, pēc tam sterilizējiet un pirms lietošanas atdzesējiet, lai savāktu nelielu baktēriju paraugu. Pēc tam viegli samaisiet.
- Buljonā sagatavotās baktērijas vēlreiz jāsamaisa, izmantojot virpuli, pēc tam jāņem kopā ar inokulācijas cilpu, kā norādīts iepriekš, nepievienojot ūdeni.
- Ja jums ir uztriepju paraugs (parasti tas tiek darīts ar mazu rokturi ar kokvilnas galu), pieskarieties tamponam un viegli to pagrieziet virs slaida.
Solis 4. Nedaudz augsta temperatūra var radīt labu uztriepi
Siltums noturēs baktērijas priekšmetstikliņa augšpusē, tāpēc krāsošanas laikā tās viegli neizšķīst. Ātri pieskarieties priekšmetstiklam divas līdz trīs reizes virs Bunsen degļa vai sildiet priekšmetstikliņu virs elektriskā slaidu sildītāja. Nepārkarsējiet, paraugs var tikt bojāts. Ja izmantojat Bunsen degli, tai vajadzētu būt nelielai, bet zilai liesmai, nevis lielai oranžai liesmai.
Alternatīvi uztriepi var veikt arī ar metanolu, sausai uztriepei pievienojot 1-2 pilienus metanola, atlikušo metanolu izžāvējot uz priekšmetstikliņa, atstājot to brīvā dabā. Šī metode samazina šūnu bojājumus un nodrošina tīru slaidu attēla fonu
5. solis. Novietojiet slaidu virs krāsošanas paplātes
Krāsošanas paplātes ir izgatavotas no metāla, stikla vai sekla plastmasas plāksnēm, un augšpusē ir mīksta sieta. Novietojiet priekšmetstikliņus virs šiem tīkliem, lai izmantoto šķidrumu varētu novadīt paplātē.
Ja jums nav krāsošanas paplātes, varat novietot slaidu uz plastmasas paplātes, lai izdrukātu ledus gabaliņus
2. metode no 3: Gram Stain Process
1. solis. Ielejiet uztriepi ar kristālvioletu šķidrumu
Izmantojiet pipeti, lai izsmidzinātu baktēriju paraugu ar dažiem pilieniem kristālvioletās krāsas, kas pazīstama arī kā genciāna violeta. Atstājiet to 30-60 sekundes. Kristālvioleti (KV) ūdens šķīdumā atdalās KV+ un hlorīda (Cl-) jonos. Šie joni iekļūst gan grampozitīvo, gan gramnegatīvo baktēriju šūnu sieniņās un šūnu membrānās. KV+ jons mijiedarbojas ar baktēriju šūnu negatīvi lādētajiem komponentiem, piešķirot šūnām purpursarkanu krāsu.
Daudzās laboratorijās nokrišņu novēršanai tiek izmantota kristālvioleta "Hucker", kas satur amonija oksalātu
2. solis. Viegli izskalojiet kristālvioleti
Nolieciet priekšmetstikliņu un izmantojiet mazgātāja pudeli, lai izsmidzinātu nelielu destilēta vai krāna ūdens plūsmu. Ūdenim vajadzētu tek pa uztriepes virsmu, un to nedrīkst izsmidzināt tieši uz uztriepes. Neskalojiet pārmērīgi. Tas var noņemt grampozitīvu baktēriju iekrāsošanos.
Solis 3. Noskalojiet uztriepi ar jodu, pēc tam noskalojiet
Izmantojiet pilinātāju, lai izskalotu uztriepi ar jodu. Atstājiet to ieslēgtu vismaz 60 sekundes, pēc tam rūpīgi izskalojiet tāpat kā iepriekš. Jods negatīvi lādēta jonu veidā mijiedarbojas ar KV+, veidojot lielu savienojumu kompleksu starp kristālvioleti un jodu (CV-I savienojumu komplekss)) šūnas iekšējā un ārējā slānī. Šis savienojumu komplekss šūnā, iekrāsotajās vietās, saglabās kristālvioleti violeto krāsu.
Jods ir kodīga viela. Izvairieties no ieelpošanas, norīšanas vai saskares ar ādu
4. solis. Pievienojiet krāsu balinātāju, pēc tam ātri noskalojiet
Šim svarīgajam solim parasti izmanto 1: 1 acetona un etanola maisījumu, kuram rūpīgi jāiestata laiks. Novietojiet priekšmetstikliņu noteiktā leņķī, pēc tam pievienojiet krāsu balinātāju, līdz skalošanai izmantotajā ūdenī vairs nav redzama violeta krāsa. Tas parasti aizņem mazāk nekā 10 sekundes vai pat mazāk laika, ja balinātājs satur augstu acetona koncentrāciju. Nekavējoties pārtrauciet šo darbību, pretējā gadījumā krāsa no grampozitīvajām un negatīvajām šūnām izskalos arī kristālvioleti, un krāsošanas process ir jāatkārto. Nekavējoties izskalojiet lieko krāsu balinātāju, izmantojot iepriekšējo paņēmienu.
- Kā aizstājēju var izmantot tīru acetonu (95%+). Jo vairāk acetona lietojat, jo ātrāk balinātājs darbosies, tāpēc jums jāpievērš lielāka uzmanība laikam.
- Ja jums ir grūtības izsekot šīs darbības laikam, pilienu pa solim pievienojiet krāsu balinātāju.
5. solis. Apkaisiet uztriepi ar pretkrāsu, pēc tam noskalojiet
Pretplāksni, parasti safranīnu vai fuksīnu, izmanto, lai palielinātu kontrastu starp gramnegatīvām un grampozitīvām baktērijām, iekrāsojot bezkrāsainas (dekolorizētas) baktērijas, t.i., gramnegatīvas baktērijas, rozā vai sarkanā krāsā. Atstājiet vismaz 45 sekundes, pēc tam noskalojiet.
Fuksīns intensīvi krāsos daudzas gramnegatīvas baktērijas, piemēram, Haemophilus spp un Legionella spp. Šī metode ir laba iesācējiem
6. solis. Nosusiniet priekšmetstikliņu
Jūs varat tos nožūt brīvā dabā, lai nožūtu, vai nožāvēt, izmantojot šim nolūkam pārdotu Bībeles papīru. Gram krāsošanas process ir pabeigts.
3. metode no 3: Krāsošanas rezultātu pārbaude
Solis 1. Sagatavojiet gaismas mikroskopu
Novietojiet priekšmetstikliņu zem mikroskopa. Baktēriju izmēri ir ļoti atšķirīgi, tāpēc kopējais nepieciešamais palielinājums mainīsies no 400x līdz 1000x. Lai iegūtu asāku attēlu, ieteicams izmantot objektīvu ar iegremdēšanas eļļu. Nometiet iegremdējamo eļļu uz priekšmetstikliņa, izvairoties no kustībām pilēšanas laikā, lai neveidotos burbuļi. Pārvietojiet mikroskopa objektīva rokturi tā, lai objektīva lēca nofiksētos vietā un pieskartos eļļai.
Eļļas iegremdēšanu var izmantot tikai uz īpaši izstrādātām lēcām, nevis uz "sausām"
2. solis. Mēģiniet identificēt grampozitīvas un gramnegatīvas baktērijas
Pārbaudiet priekšmetstikliņu gaismas mikroskopā. Grampozitīvās baktērijas ir purpursarkanā krāsā, jo kristāla violeta ir iesprostota biezā šūnu sienā. Gramnegatīvās baktērijas būs rozā vai sarkanā krāsā, jo kristālvioleta tiek izskalota caur plānām šūnu sieniņām, kur iekļūst rozā pretkrāsa.
- Ja paraugs ir pārāk biezs, rezultāts var būt kļūdaini pozitīvs. Krāsojiet jaunu paraugu, ja tas parāda visas grampozitīvās baktērijas, lai pārliecinātos, ka rezultāts ir pareizs.
- Ja izmantojat pārāk daudz krāsu balinātāju, rezultāts var būt kļūdaini negatīvs. Krāsojiet jaunu paraugu, ja tas parāda visas gramnegatīvās baktērijas, lai pārliecinātos, ka rezultāts ir pareizs.
Solis 3. Salīdziniet redzamos rezultātus ar atsauces attēlu
Ja jūs nezināt, kā izskatās baktērijas, izpētiet atsauces attēlu kolekciju, kas parasti sakārtota pēc formas un gramu traipa. Jūs varat arī apskatīt tiešsaistes datu bāzes [Nacionālajā mikrobu patogēnu datubāzē, Baktērijas fotoattēlos un daudzās citās tiešsaistes vietnēs. Lai atvieglotu identificēšanu, zemāk ir piemēri baktērijām, ar kurām parasti sastopas vai kuras ir svarīgas diagnozei, klasificējot pēc to gramatiskā stāvokļa un formas.
4. solis. Nosakiet grampozitīvās baktērijas, pamatojoties uz to formu
Baktērijas tālāk klasificē pēc formas mikroskopā, visbiežāk tās ir koki (sfēriski) vai stieņi (cilindriski). Šeit ir daži grampozitīvu baktēriju piemēri (purpursarkanā krāsā) atbilstoši to formai:
- Grampozitīvi koki parasti stafilokoki (tas nozīmē grupas koki) vai streptokoki (tas nozīmē ķēdes koki).
- "Grampozitīvi stieņi, piemēram, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium un Listeria. Stieņu baktērijas Actinomyces spp. parasti ir zari vai pavedieni.
5. solis. Nosakiet gramnegatīvās baktērijas
Gramnegatīvās baktērijas (rozā krāsā) bieži klasificē trīs grupās. Koki ir sfēriskas formas, stieņi ir gari un plāni, bet kokoīda stieņi atrodas starp tām.
- Gramnegatīvi koki Visizplatītākā ir Neisseria spp.
- Gramnegatīvi stieņi piemēram, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas un daudzi citi. Vibrio cholerae var uzskatīt par parastu kātu vai saliektu kātu.
- Gramnegatīvas "kokoīdu" (vai "kokobakteri") stieņu baktērijas piemēram, Bordetella, Brucella, Haemophilus un Pasteurella
6. solis. Rūpīgi pārbaudiet, vai rezultāti ir dažādi
Dažas baktērijas ir grūti precīzi krāsot, jo to šūnu sienas ir trauslas vai vaskotas. Šīs baktērijas var parādīt purpursarkanu vai rozā maisījumu vienā šūnā vai starp dažādām šūnām vienā uztriepi. Baktēriju paraugi, kas vecāki par 24 stundām, var parādīt šo problēmu, taču ir arī dažas baktēriju sugas, kuras jebkurā paraugu ņemšanas vecumā joprojām ir grūti krāsot. Šo baktēriju identifikācijai ir vajadzīgi vairāk specializēti testi, piemēram, krāsošana ar skābēm, novērošana baktēriju kultūrā, SITS barotne vai ģenētiskā pārbaude.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium un Propionibacterium spp. visas ir grampozitīvas baktērijas, bet bieži vien nav skaidri iekrāsotas.
- Mazas, slaidas baktērijas, piemēram, Treponema, hlamīdijas un Rickettsia spp. grūti notraipīt ar Gram metodi.
7. solis. Izmetiet visus atlikušos palīgmateriālus un aprīkojumu
Šī atkritumu apglabāšanas procedūra dažādās laboratorijās atšķiras un ir atkarīga no izmantotajiem materiāliem. Parasti šķidrumu krāsošanas paplātē izmet pudelēs, kas apzīmētas kā bīstamie atkritumi. Mērcē priekšmetstikliņus 10% balinātāja šķīdumā un pēc tam izmetiet asu priekšmetu traukā.
Padomi
- Atcerieties, ka gramu krāsošanas rezultāti būs labi tikai tad, ja paraugs ir labs. Ir svarīgi informēt pacientus, lai viņi varētu iegūt labu paraugu (piemēram, atšķirība starp spļaušanu un dziļu klepu, lai iegūtu krēpu paraugu).
- Kā krāsu balinātājs etanols reaģē lēnāk nekā acetons.
- Lai nodrošinātu drošību, ievērojiet standarta laboratorijas noteikumus.
- Praktizējiet ar vaigu tamponu, jo tas satur gan grampozitīvas, gan gramnegatīvas baktērijas. Ja redzat tikai viena veida baktērijas, iespējams, izmantojat pārāk maz vai pārāk daudz balinātāja.
- Slaidu nostiprināšanai varat izmantot koka aizdares.
Brīdinājums
- Acetons un etanols ir viegli uzliesmojošas vielas. Acetons noņems eļļu no rokām, padarot ādu vieglāk absorbēt citas ķīmiskas vielas. Valkājiet cimdus un lietojiet tos uzmanīgi.
- Neļaujiet uztriepei nožūt, pirms esat noskalojis Gram traipu vai pretpārklājumu.
Ko tev vajag
- Tīkla paraugs
- Stikla slaids
- Pipete
- Neliels uguns avots vai slaidu sildītājs vai metanols
- Ūdens
- Kristāla violeta
- Jods
- Krāsu balinātājs, piemēram, alkohols vai acetons
- Safranīns
